자연과학 자료등록 생화학실험 자료등록 단백질 정량 분석 - BCA법 & SDS-PAGE 분석 & Western Blot 다운로드 FV

자연과학 자료등록 생화학실험 자료등록 단백질 정량 분석 - BCA법 & SDS-PAGE 분석 & Western Blot 다운로드
 

실험 일시:

1. 제목 : 단백질 정량 분석 BCA법 & SDS-PAGE 분석 & Western Blot

2. 실험 목적
: BCA Method를 이용하여 우유 중의 단백질 함량을 분석하고 SDS-PAGE와 Coomassie Blue 염색을 통해 단백질의 전기영동 결과를 관찰한 것을 바탕으로 Western Blot을 시행하여 membrane에 transfer시켜, 항원-항체 반응을 이용하여 특정한 단백질의 정량 분석과 검출하는 방법을 실험을 통해 숙지한다.

3. 이론
Ⅰ. 단백질 정량법
1) BCA(Bicinchoninic Acid) 법
- 단백질이 구리 이온(Cu2+, Cu1+)을 환원 (Reduction) 시킬 수 있는 성질을 이용

Fig 1. BCA 원리 모식도
- 단백질에 의해 환원된 구리 이온은 BCA용액과 반응을 해서 보라 빛의 화합물을 생성
- 이 화합물은 빛의 특정 영역(562nm)에서 구리 이온이 담긴 용액과 BCA용액 각각보다 빛의 흡수율이 높기에, spectrophotometer를 사용해서 측정하면 흡수율 차이를 측정할 수 있다.
- 단백질의 양이 많으면 보다 많은 보라빛 화합물이 생성 → 그 화합물은 빛을 더 많이 흡수. 즉 흡수율이 증가 → 그것에 비례해서 Sample에 있는 단백질 양을 결정
- 단백질 농도에 따른 흡수율에 대한 데이터가 있어야 그 결과가 의미를 가진다.
- 어떠한 농도에선 흡수율이 어느 정도이고, 다른 농도에선 흡수율이 어느 정도 라는 것이 측정되어 표준이 정해져 있다면, 흡수율만 알면 농도를 구할 수 있는 것이고, 농도를 알면 그 Sample의 단백질 양을 알 수 있다.

장점
- 단일시약을 사용하기 때문에 방법이 간단하고 최종시료의 안정성이 높아 넓은 범위의 온도에서 단백질 정량이 가능
- Lowry assay보다 방해 물질은 적다.

단점
- 반응이 느리다.
- 단백질이 변성될 수 있다.

측정범위
- Standard Assay : 10~1200㎍/㎖
- Micro-assay:0.5-10㎍/㎖
2) Lowly assay(Folin-Ciocalteau)

원리
: Lowry 등이 고안한 이 단백질 정량분석법은 용액에 있는 단백질뿐 아니라 건조된 시료에도 이용될 수 있다. 단백질의 아마이드 결합에 의한 구리이온의 환원을 토대로 측정하는 방식입니다. (Cu2+ ` Cu1+)

장점
: 5ug/ml정도의 단백질 양을 정량 할 수 있는 민감하다.

단점
: 절차가 복잡. 다른 화합물에 의해 간섭을 많이 받는다.

Lowry assay의 일종으로 개발된 method
: - BCA method, Peterson Method 등

3) Bradford assay

원…(생략)
 

        
(이미지를 클릭하시면 확대/미리보기를 볼 수 있습니다.)